1 引言
目前，生物修复被认为是最为经济有效的处理石油污染土壤的技术，主要依靠环境中的微生物以有机污染物为碳源进行新城代谢，从而净化土壤[1-2]。微生物细胞膜的功能之一是扩散屏障，即阻止碳氢化合物和亲脂性化合物向细胞内扩散[3]，但大量研究表明吸附在微生物细胞表面的烃类物质主要通过三种方式进入微生物体内，即被动运输，主动运输和整批转运[4]。Bateman 等[5]发现即使在细胞外基质中加入ATP 生成抑制剂，萘仍会顺利被转移到降解菌Pseudomona puidat 体内，因此认为萘通过简单扩散方式进入微生物体内。Shishido [6] 的研究结果表明，苯酚在浓度低于50 mg·L-1 时以主动运输方式进入降解菌体内，而在浓度较高时以被动运输的方式进入微生物细胞内。Kennedy[7]认为细菌直接吸附在油滴上然后烃类通过扩散或主动运输的方式进入菌株体内。Beal R[8]观察到接种量高时PG201 对正十六烷的降解率低于接种量低时十六烷的降解率，从而推测这一现象与正十六烷的运输方式有关。
Steinbuchel 和Ratledge[9-11]等人在研究中发现许多能降解烷烃类物质细菌在代谢过程中会产生不同的脂类物质，然后微生物将这些亲脂性物质以特定的形式储存在细胞内。文章在此基上，利用两种高效石油降解菌DQ01 和DQ02 为对象，研究吸附在微生物表面的正十六烷以何种方式进入微生物体内，以及细胞内烷烃的存在形式。
2 材料和方法
2.1 实验材料和仪器
无机盐培养基（MSM）：5%KH2PO4，0.1%NH4Cl，0.02%MgSO4 7H2O，0.0015%CaCl2，1mL 微量元素/L 培养基(每100mL 溶液包含0.5mg CuSO4·5H2O，1.0mg H3BO3，1.0mgMnSO4·5H2O, 7.0mg ZnSO4)，去离子水定容到1000mL，115℃湿热灭菌20min。
葡萄糖液体培养基：0.15%K2HPO4，0.02%MgSO4·7H2O，0.5%蛋白胨，1%葡萄糖，去离子水定容到1000mL，115℃湿热灭菌20min。
正十六烷培养基：在无机盐培养基中加入一定浓度的正十六烷。
仪器：Varian3800 气相色谱仪（美国瓦里安技术有限公司），THZ-C 恒温振荡器（哈尔滨东联公司），真空抽滤装置（北京康林科技），J-25 型高速离心机（美国BECKMAN公司），JY96-Π 超声波细胞粉碎机（宁波新芝公司），BX41 显微镜（OLYMPUS），120kVTecnai20 透射电子显微镜（FEI 香港有限公司），UV-240 紫外分光光度计（上海精密科学有限公司）。
2.2 实验方法
2.2.1 菌种对不同浓度正十六的运输富集试验
将微生物在温度为30℃的牛肉膏蛋白胨培养基中培养3d，然后4℃下储存。细胞从固体培养基中接种到液体培养基中，30℃下培养过夜。移取5mL 培养液以6000r/min 离心5min，过滤掉上清液后，剩下的菌体用5mL 灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2 次，并以5mL 灭菌的无机盐培养基重悬，以10％的体积比接种到无机盐培养基中，加入一系列不同浓度（1、10、20、30、40、50、100 mg·L-1）的正十六烷，20min 后将培养液离心，菌体用无机盐培养基清洗1 次，乙醇/丁醇/氯仿（体积比为10/10/1）清洗细胞2 次，再用灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2 次，以去除吸着在表面的烷烃。然后重悬于10mL 10mmol·L-1 的Tris-HCl(pH=7.5) 中，冰浴超声破壁，每次3s 共60 次，每次间隔7s， 离心分离(7000r/min,10min)，上清液用等体积正己烷超声萃取2 次。收集有机相，并用无水硫酸钠脱水，在旋转蒸发定容到1mL，用GC 测定浓度。富集的烷烃就是DQ01 和DQ02 体内烷烃的量。
2.2.2 菌种细胞内外正十六烷含量分析
这部分实验是为了分析烷烃从细胞外进入细胞内是顺浓度梯度还是逆浓度梯度。具体方法如下：微生物在温度为30℃的牛肉膏蛋白胨培养基中培养3d，然后4℃下储存。细胞从固体培养基中接种到液体培养基中，30℃下培养过夜。培养液以6000r/min 离心5min，然后菌体用5mL 灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2 次，以灭菌的无机盐培养基重悬，以10％的体积比接种到一系列试管中，加入20 mg·L-1 十六烷，分别在1、2、5、10、15、20、30、40、60min 里将细菌离心，菌体用无机盐培养基清洗1 次，乙醇/丁醇/氯仿（体积比为10/10/1）清洗细胞2 次，再用灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2 次，用GC 测定清洗溶液中的正十六烷，即为吸着在微生物表面的烷烃。细胞膜内烷烃富集量的分析见2.2.1。