【摘要】 目的: 研究硝酸甘油(GTN)对对乙酰氨基酚（AP）肝毒性的影响与机制. 方法： 小鼠ip GTN 0.1~1.6 mg/kg，15 min后ip AP 300 mg/kg，6 h后测定血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)；GTN（1.6 mg/kg）预处理小鼠，测定AP半数致死量（LD50）；荧光法测定肝蛋白S?亚硝基化水平；分光光度法测定肝谷氨酸脱氢酶(GDH)活性；S?亚硝基谷胱甘肽（GSNO）处理GDH纯酶，Saville?Griess法测定其S?亚硝基化水平，并观察对N?乙酰?p?苯醌亚胺（NAPQI）灭活GDH效应的影响. 结果： GTN降低AP导致的ALT，AST升高，使AP对小鼠LD50由321 mg/kg上升至762 mg/kg；GTN引起肝蛋白S?亚硝基化水平升高，使AP对肝GDH的抑制作用完全消失；GSNO诱发GDH纯酶发生S?亚硝基化，且不影响酶活性，但修饰后的GDH不被NAPQI灭活. 结论： GTN可减轻AP肝毒性，其机制与诱发肝蛋白巯基S?亚硝基化，减少NAPQI与蛋白（如GDH）巯基的共价结合有关.
【关键词】 对乙酰氨基酚；硝酸甘油；S?亚硝基化；谷氨酸脱氢酶；肝毒性；肝/药物作用
0引言
对乙酰氨基酚(acetaminophen, AP)过量致肝实质细胞向心性坏死是西方国家急性肝功能衰竭的首要病因［1］．目前认为，过量AP经肝P450酶系代谢活化，产生N?乙酰?p?苯醌亚胺［N?acetyl?p?benzoquinone imine,(NAPQI)］，后者迅速与还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）的巯基结合，使其耗竭后进而与蛋白巯基结合，破坏蛋白功能而引发毒性. 补充GSH是较为满意的防治措施［1］. 本研究选用硝酸甘油（glyceryl trinitrate，GTN)诱导肝蛋白巯基发生S?亚硝基化修饰［2］，以保护蛋白巯基，减少或避免NAPQI攻击，观察是否可减轻AP肝毒性.
1材料和方法
1.1材料AP，NAPQI，2,3?二氨基萘（2,3?diaminonaphthalene, DAN），Griess试剂，牛肝谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, GDH)(美国Sigma公司)；5?磺基水杨酸（5?sulfosalicylic acid，SSA），GSH，氯化汞（HgCl2），亚硝酸钠(美国Amresco公司)；谷丙转氨酶（ALT），谷草转氨酶（AST）活性测定试剂盒（宁波亚太生物技术有限公司）；GTN注射液（山东华信制药有限公司）；超滤管（美国Millipore公司）；预装脱盐柱，荧光分光光度计，紫外分光光度计(美国Bio?rad公司)．雄性昆明小鼠，体质量18~20 g，由西安交通大学实验动物中心提供.
1.2方法
1.2.1动物实验方案实验一:80只小鼠，禁食不禁水10 h，随机分为8组，每组10只，分别ip给药：GTN(0.1, 0.4, 1.6 mg/kg)，AP(300 mg/kg)，GTN+AP（先注射GTN，15 min 后注射AP），对照组ip等体积生理盐水. 给药后6 h摘眼球取血，制备血清，按照试剂盒说明书测定ALT和AST活性；同时取肝脏，称质量后剪碎，以5倍体积50 mmol/L磷酸缓冲液(pH=7.4)匀浆，1000 g离心10 min，保留上清，取100 μL 测定GDH催化活性，其余样品脱盐后测定蛋白S?亚硝基化水平. 实验二：测定LD50，采用140只小鼠，随机分为14组，每组10只，禁食15 h，其中7组ip GTN 1.6 mg/kg，另7组ip等体积生理盐水，15 min后均ip AP：生理盐水组AP剂量分别为800，571，408，292，208，149，106 mg/kg，GTN预处理组AP剂量分别为1500，1071，765，547，390，279，199 mg/kg；AP加热至50℃溶解，给药容积为15 mL/kg；观察给药后24 h内各组小鼠死亡率，计算LD50.
1.2.2GDH催化活性测定按照文献［3］进行.
1.2.3荧光法测定肝蛋白S?亚硝基化水平蛋白浓度调整为5 g/L，取1 mL进行实验，样品等分为二，一份加入HgCl2分解S?亚硝基化蛋白，释放一氧化氮（nitric oxide, NO）与DAN（溶解于0.62 mol/L HCl）反应，生成荧光物质，另一份加入HgCl2的溶剂作为对照，样品调pH为中性后加SSA沉淀蛋白，离心取上清，测定荧光强度，激发波长380 nm，吸收波长450 nm，以亚硝酸钠做标准曲线，折算蛋白S?亚硝基化水平［4］.
1.2.4S?亚硝基谷胱甘肽（S?nitrosoglutathione，GSNO）的合成与定量200 mmol/L亚硝酸钠与200 mmol/L GSH（均溶解于0.5 mol/L HCL）等体积混合，室温避光反应5 min，得红色产物，用1 mol/L NaOH调pH至中性，以消光系数定量［5］.
1.2.5GDH与GSNO及NAPQI反应GDH透析除去硫酸铵，蛋白浓度调整为1 g/L，取1 mL与等体积GSNO（终浓度0，20，200，2000 μmol/L）室温避光反应30 min，采用脱盐柱去除过量GSNO，一半样品用于测定GDH催化活性，并以Saville?Griess法测定酶蛋白S?亚硝基化水平［6］，剩余样品调整蛋白浓度为0.25 g/L，取1 mL加入NAPQI 1 μL，使其终浓度为10, 30, 90 μmol/L， 室温反应30 min，利用超滤管进行脱盐浓缩，测定GDH催化活性与S?亚硝基化水平［6］；上述实验均重复5次.
统计学处理：数据以x±s表示，用SPSS 13．0软件包进行方差分析(ANOVA)，多重比较采用LSD?t检验法，组间方差不齐时，采用非参数秩和检验法，采用Bliss法计算LD50.
2结果
2.1GTN改善AP导致的血清生化指标改变小鼠单独注射AP 300 mg/kg，血清ALT和AST较对照组均升高（P<0.05）；单独注射GTN，各剂量组均不影响ALT和AST活性；GTN与AP合用，血清AST和ALT较单用AP降低（P<0.05），但与对照组比较，ALT和AST仍偏高（P<0.05，表1）. 在GTN剂量方面，预实验发现，GTN剂量达到50 mg/kg时，小鼠全部死亡；剂量小于0.05 mg/kg时，保护作用几乎消失；剂量大于2.0 mg/kg 时, 保护作用逐渐减弱. 表1硝酸甘油和对乙酰氨基酚对小鼠血清生化指标的影响